توضیحات
معرفی دوره
وسترن بلات یکی از تکنیکهای قدرتمند برای شناسایی و تحلیل پروتئینهای خاص در یک نمونه است. در اینجا مراحل اصلی و تجهیزات مورد نیاز برای انجام وسترن بلات رو برات توضیح میدم:
۱. نمونه وسترن بلات:
- نمونهای که میخوایم تحلیل کنیم معمولاً یک نمونه پروتئینی از سلول، بافت یا مایعات زیستی مثل خون است.
۲. مراحل انجام وسترن بلات:
• الکتروفورز SDS-PAGE: ابتدا پروتئینها رو با SDS-PAGE جدا میکنیم.
• انتقال به غشای نیتروسلولوز یا PVDF: پروتئینهای جدا شده روی یک غشای نازک انتقال داده میشن.
• بلاکینگ: غشا رو با محلول بلاکینگ مخلوط میکنیم تا از اتصال غیر اختصاصی جلوگیری بشه.
• پروبینگ: غشا رو با آنتیبادی اولیه (که به پروتئین مورد نظر متصل میشه) و سپس با آنتیبادی ثانویه (که نشاندار شده) مخلوط میکنیم.
• شناسایی: با استفاده از سیستمهای نشاندار (مثل ECL یا رنگآمیزی)، باندهای پروتئینی مشخص میشن.
۳. تجهیزات مورد نیاز:
• الکتروفورز: دستگاه SDS-PAGE.
• غشا: نیتروسلولوز یا PVDF.
• آنتیبادیها: اولیه و ثانویه.
• محلولهای شیمیایی: برای بلاکینگ و شناسایی. وسترن بلات به ما این امکان رو میده که پروتئین خاصی رو در نمونه پیدا و اندازهگیری کنیم.
سرفصلهای آموزشی
بخش تئوری
- استخراج پروتئین از سلول های باکتریایی
- معرفی SDS-PAGE (کاربرد و اصول SDS-PAGE)
- آماده سازی نمونه برای SDS-PAGE (نمونه های Supernatant، رسوب باکتری،…)
- روش انجام SDS و بافرهای موردنیاز
- روش های رنگ آمیزی و ارزیابی پروتئین
- معرفی اصول اولیه وسترن بلاتینگ
- انتقال پروتئین از ژل برو روی غشاء نیتروسلولزی
- اتصال آنتی بادی به پروتئین هدف و آشکار سازی هویت پروتئین
- معرفی خطاهای رایج و ارائه راه حل
بخش عملی
- تهیه ژل آکریل آمید
- آماده سازی نمونه برای SDS-PAGE
- بارگذاری نمونه روی ژل SDS-PAGE
- رنگ آمیزی نمونه های SDS-PAGE (کماسی بلو)
- انتقال نمونه ها از ژل به کاغذ نیتروسلولزی
- بارگذاری آنتی بادی اولیه و ثانویه
- آشکارسازی فعالیت آنزیمی آنتی بادی اتصال یافته به پروتئین هدف